ANALISIS HASIL ELEKTROFORESIS MENGGUNAKAN RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).

ANALISIS HASIL ELEKTROFORESIS MENGGUNAKAN RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).

Mata Kuliah : Biologi Molekuler

RFLP adalah sebuah metode yang digunakan oleh ahli biologi molekuler untuk mengikuti urutan tertentu DNA seperti  yang disampaikan  kepada sel-sel lain. Sebuah RFLP adalah urutan DNA yang memiliki pembatasan situs pada setiap ujungnya dengan "target" urutan di antara keduanya. Sebuah sekuens target adalah setiap segmen DNA yang mengikat  untuk suatu penyelidikan  dengan  membentuk  pasangan  basa komplementer. Sebuah probe urutan DNA beruntai tunggal yang telah ditandai dengan radioaktivitas atau enzim sehingga probe dapat dideteksi. Ketika pasangan basa probe ke target, penyelidik dapat mendeteksi mengikat ini dan tahu di mana urutan target adalah karena probe terdeteksi.

Restriction Fragment Length polymorphism (RFLP) merupakan penanda molekul yang pertama kali ditemukan dan digunakan. Penggunaannya dimungkinkan semenjak orang menemukan enzim endonuklease restriksi (RE), suatu kelas enzim yang mampu mengenal dan memotong seurutan pendek basa DNA (biasanya 4-6 urutan basa). Enzim ini  dihasilkan  oleh  bakteri  dan  dinamakan  menurut  spesies  bakteri  yang menghasilkannya.

Metode RFLP diestimasi berdasarkan perbedaan ukuran fragmen DNA. Susunan nukleotida spesifik pada sekuens DNA dipotong dengan enzim retriksi endonuclease berdasarkan  ukurannya.  Selanjutnya  hasil  pemotongan  enzim  retriksi  endonuclease tersebut dicampur dengan DNA probes dan dilakukan analisis southern bolt. Fragmen DNA yang komplementer dengan probes akan terhibridisasi dan muncul pada layer. Polimorphisme dideteksi berdasarkan perbedaan ukuran fragmen yang muncul. Polimophisme yang dihasilkan dapat disebabkan karena adanya mutasi, insersi, delesi,

dll.

Sebagai contoh, RFLP tertentu yang ditetapkan oleh enzim restriksi EcoR I dan urutan target sebesar 20 basis GCATGCATGCATGCATGCAT.  EcoR akan mengikat kepada   pengakuan   seuqence   GAATTC   dan   memotong   DNA   beruntai   ganda.

Probe  DNA  di  gunakan  dalam  analisis  polimorfisme  pembatasan  panjang  fragmen (RFLP- Restriction Fragment Length Polymorphisms), yang menjadi semakin berharga dalam prosedur medis, mengandalkan pada pendeteksian berbagai ukuran fragmen (Polymorphisms)  yang di hasilkan ketika potongan  DNA genomik  yang mengandung suatu gen tertentu dan daerah analog yang mengandung alel mutan nya di belah oleh suatu enzim pembatas. Elektroforesis gel, autoradiografi, dan probe DNA berlabelradio digunakan untuk mendeteksi dua fragmen berbeda. Protokol diagnostik ini sekarang di gunakan dengan berhasil untuk diagnosis prenatal dari anemia sel sabit,Fibrosis kistik, Korea Huntington, Distrofi Muskular Duchenne, dan penyakit ginjal polikistik dewasa. Karena tidak ada dua genom manusia yang memiliki rangkaian basa yang identik. Maka RFLP   dewasa   ini   di   gunakan   oleh   pengetahuan   kedokteran   kehakiman   untuk mendapatkan  sidik  jari  DNA  manusia,  di  mana  tidak  ada  dua  sidik  jari  yang  sama. Dengan demikian,karena setiap sidik jari DNA manusia adalah unik, maka RFLP terbukti merupakan alat penyelidikan yang kuat untuk membantu petugas hukum dalam menyelesaikan masalah kejahatan.

Untuk menghitung jarak genetik antara untuk lokus, harus mampu mengamati rekombinasi.. Secara tradisional, ini dilakukan dengan mengamati fenotipe, tetapi dengan analisis RFLP, adalah mungkin untuk mengukur jarak genetis antara dua lokus RFLP apakah  mereka  merupakan  bagian  dari  gen  atau  tidak.  Deteksi  RFLP  dilakukan berdasarkan pada adanya kemungkinan untuk membandingkan profil pita-pita yang di hasilkan setelah di lakukan pemotongan dengan enzim restriksi terhadap DNA target atau dari individu yang berbeda. Berbagai mutasi yang terjadi pada suatu organisme mempengaruhi  molekul  DNA  dengan  berbagai  cara,menghasilkan  fragmen-fragmen dengan panjang yang berbeda. Aplikasi tekhnik RFLP biasa di gunakan untuk mendeteksi diversitas genetic,hubungan kekerabatan,sejarah domestikasi,asal dan evolusi suatu spesies,genetic  drift dan seleksi,pemetaan  keseluruhan  genom,tagging  gen,mengisolasi gen-gen yang berguna dari spesies liar,mengkonstruksi perpustakaan DNA.

RFLP bersifat kodominan dan cukup berlimpah serta polimorfik. Penanda ini juga mudah dipetakan dalam peta genetik dan bersifat stabil. Kelemahannya, penanda ini memerlukan  DNA  dalam  jumlah  besar,  lama  (memerlukan  waktu  tiga  hari),  serta

melibatkan  penggunaan  pelabelan  isotop  radioaktif  (meskipun  kini  telah  ditemukan teknik tanpa radioaktif).

Analisis  Restriction  fragment  length  polymorphism  (RFLP)  adalah  salah  satu teknik pertama yang secara luas digunakan untuk mendeteksi variasi pada tingkat sekuen DNA.  Deteksi  RFLP  dilakukan  berdasar  pada  adanya  kemungkinan  untuk membandingkan profil pitapita Yang dihasilkan setelah dilakukan pemotongan dengan enzim restriksi terhadap DNA target/dari individu yang berbeda. Berbagai mutasi yang terjadi pada suatu organism mempengaruhi molekul DNA dengan berbagai cara, menghasilkan   fragmenfragmen   dengan   panjang   yang  berbeda.   Perbedaan   panjang fragmen ini dapat dilihat setelahdilakukan elektroforesis pada gel, hibridisasi dan visualisasi. Aplikasi teknik RFLP biasa digunakan untuk mendeteksi diversitas genetic, hubungan kekerabatan, sejarah domestikasi, asal dan evolusi suatu spesies, genetic drift dan  seleksi,  pemetaan  keseluruhan  genom,  tagging  gen,  mengisolasi  gengen  yang berguna dari spesies liar,mengkonstruksi perpustakaan DNA.

Contoh Aplikasi:

Identifikasi secara cepat isolat Candida untuk mengetahui pada tingkat spesies untuk pemilihan terapi anti jamur yang efektif dan juga kontrol fasilitas dari rumah sakit infeksi. Metode analisis berdasarkan fenotip untuk mengidentifikasi spesies Candida seringkali sulit dilakukan dan membutuhkan waktu yang lebih panjang. Teknik biologi molekular  memberikan  teknik alternatif  yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi spesies Candida secara cepat, murah dan tepat yaitu dengan teknologi analisis molekular dengan menggunakan metode restriction fragment length polymorphism (RFLP) dan aplikasinya  untuk diagnosis  secara cepat pada  spesies  Candida  yaitu C. albicans,  C. glabrata,  C.  parapsilosis,  C.  tropicalis,  C.  krusei  dan  C.  guilliermondii.  Analisis dilakukan  dengan mengamplifikasi  daerah  polimorfis  ITS1-ITS4  menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR). Hasil amplifikasi kemudian dipotong menggunakan enzim restriksi tunggal yaitu MspI. Dengan menggunakan metode PCR-RFLP dengan enzim  restriksi  tunggal  MspI,  Spesies  Candida  dapat  diidentifikasi  secara  sederhana, cepat dan hemat biaya untuk dapat diaplikasikan dalam laboratorium klinik.

MANIPULASI DNA/ KLONING GEN Oleh : Ema Lestari

Mata Kuliah : Biologi Molekuler

Kloning yaitu : gen-gen yang direkombinasi dan di kembangkan. Kloning berasal dari kata “clone” yang diturunkan dari bahasa Yunani “klon” yang artinya potongan yang  digunakan   untuk   memperbanyak   tanaman.   Kata  ini  digunakan   dalam  dua pengertian (1) klon sel adalah sekelompok sel yang identik sifat-sifat genetiknya, semua berasal dari satu sel. (2) klon gen atau molekuler adalah sekelompok salinan gen yang bersifat identik yang direplikasi dari satu gen yang dimasukan dalam sel inang. Kloning adalah suatu usaha membuat rekombinan baru, dengan cara menyusupkan asam nukleat / DNA dari sel lain, ke dalam suatu sel baru/ host melalui bantuan suatu vektor. Sel hasil rekombinan mempunyai sifat genetik sama dengan sel donor.

Organisme  yang  telah  dimodifikasi  secara  genetik  dengan  teknik  rekayasa genetik   disebut   sebagai   genetically   modified   organism   (GMO)   atau   genetically engineered organism (GEO). Teknik rekayasa ini dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan yang menggunakan molekul DNA dari berbagai sumber organisme yang disisipkan satu dengan yang lain untuk membentuk rangkaian gen yang baru. Dan kemudian DNA rekombinan ini ditransfer ke dalam sel lain yang mana gen ini akan berekspresi di sel tersebut.

Teknologi DNA rekombinan dilakukan dengan teknik seleksi dan skrining pada prosedur  mikrobiologi,  selanjutnya  peneliti  mengisolasi  suatu  gen  yang  merupakan bagian kecil dari material genetik suatu organisme DNA yang berasal dari organisme yang diinginkan dipotong-potong menjadi potongan-potongan yang kecil-kecil, masing- masing bagian disisipkan pada vektor dan ditranslasikan pada bakteri yang telah ditetapkan. Sel-sel transforman diseleksi dengan menggunakan antibiotik spesifik pada medium yang digunakan untuk mengkultur sel-sel tersebut. Proses ini disebut molecular cloning.

Tahapan teknik dasar dalam kloning gen :

1. Isolasi DNA / RNA

2. Pemotongan, penyambungan / insersi DNA / RNA.

3. Memantau hasil pemotongan atau         penyambungan DNA / RNA.

4. Transformasi pada sel host (E. coli).

5. Isolasi DNA rekombinan dari host.

6. Analisa DNA rekombinan.

Langkah-langkah dasar Kloning Gen :

Ada beberapa langkah dasar dalam Kloning Gen yaitu sebagai berikut :

1.  Suatu  frakmen  DNA  yang  mengandung  gen  yang  akan  diklon  diinsersikan  pada molekul  DNA  sirkular  yang  di  sebut  sektor  untuk  menghasilkan  chimoera  atau molekul DNA rekombiner.

2. Vektor bertindak sebagai wahana yang membawa gen masuk kedalam sel tuan rumah

( host )  yang biasanya berupa bakteri, walaaupun sel-sel jenis lain dapat di gunakan.

3. Didalam sel host, vektor mengadakan replikasi menghasilkan banyak kopi atau turunan yang identik, baik vektornya sendiri maupun gen yang dibawanya.

4. Ketika sel host membelah, kopi molekul DNA rekombinasi diwariskan pada  progeni dan terjadi replikasi vektor selanjutnya.

5. Setelah terjadi sejumlah besar pembelahan sel, maka dihasilkan koloni atau   klonsel host yang identik

Tiap-tiap sel dalam klon mengandung satu kopi atau lebih molekul DNA rekombinasi dengan  demikian  dikatakan  bahwa  gen  yang dibawa  oleh  molekul  rekombinasi  telah diklon.